使用trim_galore对NGS数据进行质量过滤

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cutadapt软件可以对NGS数据进行质量过滤，FastQC软件可以查看NGS数据的质量分布，trim_galore将这两个软件封装到一起，使用起来更加的方便。 官网如下

https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/

该软件会对数据进行以下4步处理

1. 去除reads 3’端的低质量碱基

illumina平台的测序数据，通常3’端质量较差。trim_galore首先会过滤掉3’端的低质量碱基，本质上是调用了cutadapt的质量过滤算法。下图是过滤前后碱基质量的分布图

可以看到，过滤掉低质量碱基后，序列的整体质量显著提高。

2. 去除adapter序列

过滤掉低质量的碱基之后，trim_galore会调用cutadapt在reads的3’端查找adapter 序列并去除。通常情况下，我们需要指定对应的adapter序列，如果没有指定的化，trim_galore会自动查找以下3种类型的adapter

Illumina:   AGATCGGAAGAGC
Small RNA:  TGGAATTCTCGG
Nextera:    CTGTCTCTTATA

默认读取前一百万条序列，通过这一百万条序列判断adapter属于上述三种的哪一种，然后进行去除。如果你不希望软件自动判断，也可以通过--illumina, --nextera, --small_rna参数指定对应的adapter类型。

3. 去除长度太短的序列

经过上述两步处理之后，有可能剩余的序列长度很短，这部分短序列也会被去除。默认情况下，如果序列长度少于20bp, 这条序列会被丢掉。

4. 其它过滤

对于所有的输入序列，以上3个步骤是肯定会执行的。除此之，trim_galore还支持一些其他的过滤措施，以满足个性化的需求。

hardtrim5参数用于从序列的3’端切除碱基，示意如下

before:         CCTAAGGAAACAAGTACACTCCACACATGCATA--hardtrim5 20: CCTAAGGAAACAAGTACACT

通过hardtrim5参数可以将序列截取成固定长度。与之对应的，还有一个hardtrim3参数，从序列的5’端切除碱基，示意如下

before:         CAAATGTTATTTTTAAGAAAATGGAAAAT--hardtrim3 20:          TTTTTAAGAAAATGGAAAAT

软件的安装也很方便，首先需要确保cutadapt和fastqc这两个软件已经安装，并且可执行文件位于PAH环境变量定义的路径种。然后下载trim_galore的源代码包，解压即可，代码如下

wget https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore/archive/0.5.0.tar.gz
tar xzvf 0.5.0.tar.gz

在软件的安装目录有一个名为trim_galore的可执行文件。

对于单端测序数据，基本用法如下

trim_galore  --quality 20 -a AGATCGGAAGAGC --length 20  -o out_dir  input.fq

对于双端测序数据，基本用法如下

trim_galore --paired --quality 20 -a AGATCGGAAGAGC   -a2 AGATCGGAAGAGC --length 20  -o out_dir  R1.fq.gz R2.fq.gz

更多的参数和用法请参考官方帮助文档。

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